圖1：搖床內部的設置：將搖瓶放置在杯

     在這項研究中，已經建立了搖瓶規模的反饋控制縮小模型。使用集成在搖瓶中的化學光學傳感器（PSt3型）測量釀酒酵母培養物中的溶解氧（DO）濃度。溶解氧水平觸發了按需碳進料。這種設置允許在搖瓶中進行自動補料分批培養，并提高在此規模下獲得的數據質量，而不會影響結果的數量。搖瓶培養中的不同菌株與生物反應器規模表現出相同的排名。在第二個實驗中，在反饋控制系統中測試了DO-stat和碳限制過程。結果表明，采用該裝置，該過程可以在搖瓶規模下成功進行。

圖2：釀酒酵母在按需喂養搖瓶設置中的培養。

     圖3：四種釀酒酵母菌株在搖晃片尺度（藍色）和生物反應器量表（紅色）下的比較：細胞干重（頂部），產物濃度（中）和相對生產參數Ypx（底部）。

圖4：DO-Stat：碳限制過程;DO設定值 20 %。

      在用于生產藥物、蛋白質或營養添加劑的生物工藝開發中，在測試合適的細胞系、培養基組成和工藝條件時，使用縮小模型來節省時間和成本。然而，通常很難確定小規模工藝放大的關鍵參數。搖瓶通常用于生物技術研究和生產。它們代表了昂貴的大規模生物反應器系統的低成本替代品，并且更容易處理。另一方面，沒有建立在線監測和控制這種規模的重要培養參數的系統。需要一種可靠的自動進料方法和消除手動取樣，以改善搖瓶規模的生物工藝開發。在這些實驗中，測試了可用于搖瓶培養的反饋控制系統。培養物中的溶解氧含量觸發碳源飼料，PreSens使用化學光學傳感器技術在線測量。氧傳感器集成在玻璃錐形瓶的底部，并通過透明燒瓶壁非侵入性地讀取。傳感器信號被傳輸到 OXY-10 mini，這是一款 10 通道氧計，可在多達 10 個搖瓶中同時在線測量。使用蠕動泵，根據需要自動將葡萄糖溶液添加到培養物中。在釀酒酵母培養物中按需使用脈沖飼料進行測試，并將結果與生物反應器規模（20 L）獲得的值進行比較。此外，該系統還用于測試碳限制過程，用于提高生物質和產品產量，其中DO試圖保持在20%左右。

材料與方法

      在 工作體積為100 mL的500 mL玻璃搖瓶中進行實驗，在2.5 cm投擲時搖晃速率為< 250 rpm，或在5.0 cm投擲時<200 rpm。每個燒瓶的底部都有一個氧傳感器點，并放置在Coaster CFG的頂部。杯墊是一種附件，可以將傳感器信號傳輸到氧氣計。OXY-10 mini通過RS232連接到Lantronix S2E轉換器，該轉換器連接到AdamBus A / D轉換器。AdamBus A/D-轉換器控制蠕動泵進行進料。一臺帶有Lucullus PIMS的PC用于從Lantronix S2E轉換器收集數據并監控過程。每個搖瓶連接到帶有硅膠或藥用管（直徑12 - 16管）的單個蠕動泵，允許0 - 50 g / h的流量。將試管連接到搖瓶蓋上（見圖1）。實際進料速率是通過流量與泵速的相關性計算的。首先，在8個搖瓶中對四種不同的釀酒酵母菌株進行實驗，一式兩份。根據需要將500 g / L葡萄糖溶液作為碳源以0.5小時的脈沖以20 g / h的進料速率給予培養物。進給速率和脈沖時間是經驗值。當ΔDO/10分鐘>10%時觸發進料啟動。在第二個實驗中，釀酒酵母試圖在碳限制過程中保持在靜態DO。使用150 g/L葡萄糖溶液，當ΔDO/10 min>10 %時再次觸發進料啟動。使用簡單的兩步控制器將溶解氧保持在20%的設定值，增量為0.5%。

結果

       按需饋送實驗運行96小時（見圖2）。在第一階段，初始葡萄糖被消耗，并且由于釀酒酵母的雙氧生長部分轉化為乙醇。細胞的生長導致溶解氧水平降低，并且在大約22小時（DO信號中的小峰）葡萄糖耗盡并且乙醇繼續生長。由于搖瓶的氧氣轉移能力有限，DO水平在40小時左右達到零。當乙醇也耗盡時，培養基中不存在其他碳源，導致細胞對氧的吸收減少，因此溶解氧水平升高。這種增加被用作葡萄糖添加的觸發因素。一旦再次消耗添加的葡萄糖和產生的乙醇，就開始下一個添加物。將搖瓶設置中四種釀酒酵母菌株的干重和產量與在生物反應器規模（20 L）下相同菌株獲得的結果進行比較，結果發現搖瓶培養物的細胞干重和產物濃度達到較低的輸出（圖3），這是由生物反應器的較高氧轉移容量引起的。然而，所有菌株在兩個栽培規模上都表現出相同的排名，這使得能夠挑選具有特殊特征的菌株用于以后的放大過程。相對生產參數的比較顯示，搖瓶培養值與生物反應器規模的培養值具有良好的一致性（圖3）。在第二個實驗中，自動搖瓶系統在具有靜態DO的碳限制培養中進行了測試。 圖4顯示自動飼喂系統可用于進行DO-Stat培養。當溶解氧水平低于設定值時，進給速率降低，反之亦然。所選參數（0.5%進給速率增量，1小時步進時間）已經產生了非常好的溶氧控制。使用定義的工藝條件進行進一步微調可以降低溶解氧信號的振蕩。

結論

     開發的用于搖瓶培養的按需飼喂系統顯示出良好的效果，與生物反應器規模的值進行比較，可以得出結論，可以在此規模下比較和挑選不同的菌株。此外，在此設置中進行的測試非常節省時間。在生物反應器規模下只能運行 2 或 3 個實驗的情況下，該系統允許每周進行 8 - 10 次測試。即使在碳限制過程中，系統也取得了意想不到的良好結果。在縮小比例過程中進行實驗時，能夠與PreSens OXY-10 mini同時在線和在多個搖瓶中測量溶解氧是一個重要優勢。SFR 搖瓶讀數儀允許在多達 9 個搖瓶中測量氧氣和 pH 值，進一步實驗可能會增強這種自動化且部分可控的搖瓶秤系統。已經計劃進一步開發設置